胶原蛋白为何会分层？

随着贝迪生物的胶原蛋白植入剂在近日获批（点击阅读：无锡贝迪生物胶原蛋白植入剂获批，6月2日国家药监局获批受理信息汇总），动物组织提取的 I 型胶原蛋白植入剂已有 8 个（包括同一家的多个获批产品）。我们关注到有些医师发现胶原蛋白植入剂偶有固液分层的情况，而在已公开的胶原蛋白植入剂审评报告中，有下图中一段描述：

研发方非常明确存储和运输的不当会导致胶原蛋白的固液分离。存储/运输不当会引起多种风险因子，例如温度过热过低、碰撞震动、内包材泄露等，这些因素是如何导致胶原蛋白固液分离呢？

按目前的器械分类来看，胶原蛋白通常可分为 I 型胶原蛋白（动物组织来源）和重组胶原蛋白（I 型 III 型皆有，微生物表达），还有一类是水解胶原蛋白（仅有一款敷贴获批），重组胶原蛋白和水解胶原蛋白水溶性极佳，不会出现固液分离，因此我们这里只谈论动物组织来源的胶原蛋白植入剂。

当我们看到一支合格的胶原蛋白植入剂时，它通常呈现出一种完美、均匀且通透的凝胶状态（如上图，贝迪生物胶原蛋白）。作为一种用于医疗美容注射的微整形材料，它必须在货架有效期内保持绝对的均匀不分层，并在注射时能够顺畅地通过极其细小的针头。要让分子量巨大的胶原蛋白在液体中“永不沉降”，关键在于分子的水溶性（有别于亲水性）。

动物组织来源的胶原蛋白大多是由三螺旋分子组成的胶原纤维结构。这些纤维通过酶的介导，在分子间形成了大量的共价交联键。这些交联键让三螺旋分子形成巨大的不溶性纤维网，因此胶原纤维在水中一定是分层的。

在植入剂的制备过程中，需要把不溶性的纤维水解为可溶性的胶原，一般包括以下的生产步骤（如上图，以牛跟腱为例）：来料清洗-脱毛脱脂-酶解/水解-纯化/离心/过滤-调节pH/自组装-冻干/浓缩-配液/制剂，在水解这一步，胶原变成水溶性有以下几个原因：

• 酸能够特异性地水解那些处于未成熟状态、对酸敏感的胶原分子间共价交联键（主要是某些亚胺键），让胶原变得水溶；

• 随着交联键断裂和静电排斥，那些原本被死死扣在宏观大纤维网里的三螺旋长棍，一根根地脱离了群体，游离到酸性溶液中。 此时，它们变成了游离的、保持完整三股螺旋构象的原胶原单体。在工业上，这一步得到的产物被称为酸溶性胶原（ASC）；

• 在 pH2-3 的强酸性环境下，胶原蛋白分子上的羧基（-COO）全部被质子化变成了中性的 -COOH，而氨基（-NH3）则带上了大量的正电荷。 整个胶原纤维内部瞬间充满了同种正电荷。强大的静电排斥力迫使紧密吸附的胶原纤维发生溶胀（Swelling），水分子大量涌入，将纤维之间的距离生生撑开。

胶原变得水溶/酸溶后，才能够进入纯化的步骤，再通过调节 pH/离子等方法，让水溶的胶原自组装成纤维，这个过程我们在之前的文中也有过描述（点击阅读：胶原蛋白的自组装），或者查看下方肖博士和李教授的对话（视频号中有很多两位老师关于三螺旋和自组装的视频，建议读者们认真观看）。

在纯化工序后，为了要取得中性的胶原蛋白，需要调节 pH，这一步会促使三螺旋分子之间通过侧向的静电引力、疏水相互作用以及共价交联，平行排列并紧密结合在一起，形成更粗的胶原纤维。此时，胶原又变成了不可溶的纤维网。

当胶原纤维遇到水时，水分子确实可以凭借亲水性渗透进这些大分子之间的缝隙里，让整个结构像海绵一样吸水溶胀，但依然保持着固体形态，无法化在水里。这有点类似于肉煮的再烂，也不会完全溶于肉汤中。因此上述工序最后一个配液/制剂环节，就成为了保持胶原蛋白植入剂均匀分布在水中的关键步骤。

胶原蛋白植入制剂之所以能够均匀悬浮，原因很简单粗暴：均质。这一过程类似于把煮烂的肉再进一步打成肉泥，和肉汤混在一起。自组装形成的天然胶原纤维团块尺寸太大，重力高于浮力和溶液中的阻力，必然会发生沉降分层。所以首先要把胶原纤维剪切打碎至微米级的颗粒。形成颗粒后，就可以按照斯托克斯定律来分析胶原颗粒在溶液中的浮力和阻力了，其阻力公式为：F = 6 π η r υ，其中，F 为阻力，η 为液体粘滞系数，r为颗粒半径，υ 为球体相对于液体的速度。

由此可知，阻力和半径成正比，胶原颗粒在溶液中浮力和体积成正比，阻力、浮力与自重共同影响了胶原的沉降。在制剂工艺中，当高压均质将胶原纤维的半径缩小到原来的 1/10 时，它在宏观上的沉降速度会下跌到原来的 1/100，因此小颗粒胶原往往更容易悬浮。

然而仅靠浮力和溶液的阻力是不够的。微小的纤维颗粒在长时间静置后依然可能互相靠拢，重新凝聚成大块并析出水分（如上图，胶原海绵剪碎成颗粒后悬浮分层）。所以有些产品会加入微量的交联体系（如戊二醛、BDDE），但严格控制交联度。这种交联使得每一个纤维颗粒内部形成稳定的、像微型海绵一样的微凝颗粒，相互支撑。

如果选择非交联的体系，就需要保证一定的胶原蛋白浓度（通常是＞35mg/mL），在高浓度下，吸满水的微颗粒在1mL 注射器中达到了“拥挤极限”，失去了宏观位移的自由。有个例外是获批的一款 4mg/mL 的注射用胶原溶液，可能采用了另外的制剂工艺而达到均匀悬浮，比如抑制胶原纤维的自组装，维持原胶原（三螺旋分子）的状态，以达到卓越的水溶性。

胶原蛋白的肽链侧链上同时挂着带负电的酸性基团（如谷氨酸、天冬氨酸的羧基）与带正电的碱性基团（如赖氨酸、精氨酸的氨基）。当这两种电荷的数量在特定 pH 下达到完全相等时，分子整体的净电荷便归于零，这个特定的 pH 值称为等电点（pI），天然动物源胶原的等电点通常偏碱性。

胶原蛋白在水里长久悬浮，制剂配方工艺的核心铁律就是让制剂的 pH 偏离胶原的 pI。在微酸环境下，由于环境中富含氢离子，胶原蛋白颗粒都会带上正电荷，导致颗粒之间排斥。这种微观上的“社交距离”阻断了分子的自聚，阻碍它们的进一步组装，从而在宏观上维持了长期的均匀悬浮。这一点非常类似于羟基磷灰石（CaHA）的 Zeta 电位（点击阅读：羟基磷灰石Zeta电位 - 被忽视的属性5），Zeta 电位就是可以使得 CaHA 微球在溶液中相对分散的原因之一（如上图）。

介绍完胶原蛋白的悬浮技巧，我们回到文章开始的问题：都有哪些因素导致胶原蛋白的分层和沉淀呢？

温度往往是最直接影响胶原蛋白稳定性的因素。胶原蛋白保存条件极度苛刻（通常为 2-8°C），而运输和保存条件都可能让胶原蛋白暴露在预期以外的温度下。

• 高温导致氢键断裂：胶原蛋白维持天然三维网络主要依靠弱相互作用力（氢键、疏水相互作用和离子键）。温度升高会加剧水分子的热运动，破坏这些维持凝胶网格的弱键；随着部分非共价交联点的断开，胶原蛋白肽链倾向于发生内部卷曲或局部聚集，原本被包裹在网格中的水分子（结合水和溶胀水）失去空间束缚，被挤压出来，形成显性的液体层。

• 当温度降至 0°C 以下导致制剂结冰时，水分子会聚集并结晶成冰晶，蛋白凝胶网络中的胶原蛋白纤维会被挤压到冰晶边界，造成局部胶原蛋白浓度极高、交联网络严重变形。当制剂重新融化后，被严重挤压变形的胶原蛋白纤维由于形成了新的、不均匀的分子间疏水键，无法再恢复到原本均匀包裹水分的三维网状状态。原本被冻成冰的水分子释放出来，形成自由水，导致严重的固液分离。

• 在物流运输中，频繁的运输颠簸、抛掷或高频震动会引入持续的机械剪切力，破坏弱交联物理网络。许多胶原蛋白植入剂为了保持良好的可注射性，内部存在大量的物理交联（如氢键缠绕、电荷吸引）或低密度的化学交联。持续的震动会引入剪切应力，断裂这些剪切敏感的物理网络。

• 包材密闭性破坏：碰撞导致预灌封注射器的泄漏会导致包装内部的水分向外蒸发。最先接触外界的凝胶表面水分流失，导致局部胶原蛋白浓度异常升高，产生收缩。这种不均匀的收缩力会拉扯内部完整的凝胶网络，导致内部网络受压而析出水分。

• pH 漂移：如果包材泄漏或者生产过程中导致的微生物或者二氧化碳侵入，导致制剂的 pH 向着胶原的 pI 靠近，胶原表面的正负电荷相互中和，对外表现为电中性。失去了电荷的排斥和水分子的隔离，胶原蛋白分子会进一步团聚组装，这些微观粒子在极短的时间内便可形成宏观可见的絮状团块（如下动图，离子加入蛋白溶液中导致的瞬间沉淀）。这些棉絮状的固体迅速下沉到针管底部，而上方则彻底变成被挤压出来的自由水，导致不可逆的分层。

  

  
  

总结来说，胶原蛋白植入剂的水溶和分层/沉淀都有其背后的原因，使用者在发现蛋白析出时，应按照产品审评报告的截图所示，停止使用并立即联系售后服务更换：

• 动物源胶原纤维天然不溶于水。在制剂前期的酸解工序中，通过稀酸破坏交联键，让原胶原分子可溶；

• 均质与自组装重塑： 纯化中和 pH 后，胶原再次自组装成不溶性纤维。制剂工艺通过机械剪切（均质）将其粉碎至微纳级别，增加颗粒的悬浮力；

• 悬浮稳定保障：交联和高浓度都可以让胶原颗粒悬浮；同时保持 pH 偏离等电点，利用静电排斥阻断自聚。
  

• 分层危机因子：高温破坏氢键导致网络坍塌；低温冷冻因冰晶挤压造成不可逆疏水重组；机械震动破坏触变性网络引发自聚析出；包材泄露/染菌导致水分蒸发（不均匀干缩）及 pH 漂移至等电点引发爆发式盐析沉淀。

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