在我们过往的文中，我们写过多篇关于 CaHA 植入后的炎性表现，我们发现有些研究中表明，CaHA 是无炎性的刺激，它的再生能力来自于纯粹的机械转导（点击阅读：机械转导 - 羟基磷灰石的再生机理）；而有些研究却是相反的，研究者也着实看到了 CaHA 植入后的炎性反应，无论是临床上还是动物实验中（点击阅读：羟基磷灰石微球，真的低免疫吗？）。
在我们过往内部的研究中，我们也看到了相反的结果会同时存在，有些微球是无炎性的、惰性的，有些微球是炎性引发了过量胶原的生成（点击阅读：羟基磷灰石｜胶原的再生与过度再生）。这种看似矛盾的现象，关键原因在于微球的物理特性（粒径、形状）以及注射部位微环境的差异，会影响巨噬细胞的极化方向——从而决定植入后是温和修复还是明显炎症。
在最近的一项研究中，作者有过这么一段描述：M1 型巨噬细胞的比率升高与皮肤老化和慢性炎症有关。PLLA 可以通过提高 IL-4 和 IL-13 的水平来缓解这一现象，从而促进细胞向具有再生功能的 M2 表型转变。而之前有老师询问过 CaHA 是否会在植入后伴随着细胞免疫，并影响细胞亚型的分化。
M1 和 M2 型都代表了什么？羟基磷灰石等微球又是如何调控巨噬细胞的分化，从而展示出植入后的有炎性和无炎性的再生呢？
要想了解 CaHA 的炎性调控，我们首先要了解巨噬细胞和它们的分型。巨噬细胞是一种白细胞，通过细长的伪足来锁定、吞噬并引发免疫反应清除异物（如上图）。巨噬细胞存在于人体几乎所有组织中。在某些情况下，巨噬细胞固定在组织内的特定位置，例如淋巴结和肠道中。在其他情况下，它们可能在疏松结缔组织间隙中游走。巨噬细胞可以吞噬其他细胞、病原体以及许多其他微小颗粒的能力（如下方动图）。
巨噬细胞代表异质性和多功能的已分化单核吞噬细胞群体，参与免疫应答的所有阶段，从其启动和触发适应性免疫，到炎症的消退和受影响组织的修复。此外，巨噬细胞对组织发育、重塑和稳态也很重要。
成人中的一部分粘膜和组织巨噬细胞来源于它们的前体——外周血单核细胞，后者响应趋化刺激而被吸引。巨噬细胞和单核细胞都为吞噬细胞，在脊椎动物体内参与非特异性防御（先天性免疫）与特异性防御（细胞免疫）。
巨噬细胞可以分为 M1 和 M2 型，我们在过往的一些产品信息中，常见的描述是：M1 型是促炎的，M2 型是抗炎的，这种表述不完全准确。正确的描述应该是：在面对不同的刺激时，单核细胞会分化为具有强杀菌活性的巨噬细胞（M1型），或是具有免疫抑制功能的巨噬细胞（M2型）。巨噬细胞偏差是可逆的。例如，如果 M1 巨噬细胞被赋予细胞凋亡，它可能会转变为M2巨噬细胞。而 M2 型又进一步地分为 M2a、M2b、M2c 和 M2d 等亚型。能够诱导巨噬细胞表型变化的物质包括细菌的外膜（LPS）、细胞因子和趋化因子（如下图）等。
为何说 M2 型都是抗炎不完全准确呢？因为 M2 型细胞有个“促炎叛徒”：M2b。从上图中可以看到，M1 和 M2b 都通过 LPS（细菌外膜）的刺激而分化得来，M2b 虽然属于免疫抑制型细胞，但也会分泌促炎的细胞因子 TNF（肿瘤坏死因子）和 IL6。M1 和 M2b 从分泌的因子和标志物来看非常相似，但 M1 促进 Th1 型的免疫应答，M2c 促进嗜酸性粒细胞和 Tregs（调节型 T 细胞） 的招募，从而促进 Th2 的应答。
Th1 型激活细胞免疫，更多针对病毒、细菌等胞内病原体；Th2 是体液免疫，更多针对如寄生虫、过敏原等胞外威胁。但从我们之前的文中（击阅读：体液还是细胞免疫？羟基磷灰石是哪种？）可知，微球更多是被视为“胞外异物”，而非病原体，如果一定要选择一个免疫应答类别，应该属于 Th2 应答。
M2c巨噬细胞是由 IL-10、TGF-β 和糖皮质激素的组合诱导的。反过来，这些巨噬细胞分泌 IL-10 和 TGF-β，两者都是免疫抑制细胞因子，可以促进 Th2 淋巴细胞和 Tregs 的发育。它们还表达高水平的精氨酸酶，并促进组织再生和血管生成。M2c 巨噬细胞诱导 Tregs 的能力使它们比 M2a 巨噬细胞更有效地保护器官免受炎症浸润引起的损伤。M2c 的作用和 CaHA 植入后温和的炎性反应、较高的胶原再生和血管再生惊人的吻合。CaHA 很可能是刺激更多的 M2c 型巨噬细胞的极化，受篇幅所限，我们未来择机再进一步地研究 CaHA 和 M2c 型巨噬细胞极化的关系。
需要注意的是，部分 M2 亚型（尤其是M2a、M2c）在某些肿瘤微环境中可促进肿瘤生长和转移。因此，对于已知患有活动性恶性肿瘤的患者，使用任何微球类再生产品应由医生严格评估风险与获益；对于仅有肿瘤家族史而无明确病变的人群，目前缺乏证据表明局部注射微球会增加肿瘤风险，但建议谨慎操作并充分告知。未来的研究需要进一步明确不同 M2 亚型与肿瘤关系的具体机制。细胞因子和趋化因子来自于单核细胞周围的淋巴细胞或其他非免疫细胞。根据这个原理，我们可以假设：当微球作为异物进入人体时，所接触到不同的细胞，分泌的信号很可能不同，这会导致单核细胞分化成不同型的巨噬细胞，从而导致植入后的表现有的是抗炎，有的是促炎。换句话说：微球打入到不同的部位和层次，可能会有截然不同炎性反应。
不同亚型的巨噬细胞会释放出截然不同的细胞因子和趋化因子谱系，它们既可能促进炎症反应并有时导致组织破坏，也可能促进伤口愈合和组织修复。我们在之前的文中（点击阅读：羟基磷灰石｜胶原的再生与过度再生）探索了微球再生的胶原与疤痕的关系。我们这里假设：微球在植入后造成的微环境的侵占行为，导致了一个局部的微愈合/修复过程（这里默认为微球不携带致病的微生物，不会因为杂质和细菌引起免疫应答），那么 M1 和 M2 型巨噬细胞就参与了这个过程。
愈合过程中巨噬细胞的表型是动态的，这种从促炎到抗炎的动态变化对于协调愈合的各个阶段至关重要。巨噬细胞在组织修复过程的不同阶段可以分为不同激活类型：在早期阶段，巨噬细胞表现出特征性的促炎表型，即 M1 型。M1 激活表型由 DAMPs 和伤口部位产生的其他炎症信号（如 IFNγ 和 TNF）诱导。M1 巨噬细胞具有细胞毒性和杀菌性，表达 TNF、IL-1β 和 IL-6；在愈合的后期阶段，M1 转变为 M2。M2 巨噬细胞激活可以由 IL-4 和 IL-13 触发。在早期阶段，伤口巨噬细胞产生线粒体 ROS 并驱动几个早期修复过程，而在后期阶段，巨噬细胞的特征在于线粒体呼吸和促消退功能。这种 M1 向 M2 转化的关键触发因素之一可能是其对耗竭中性粒细胞的胞葬作用，这也促进巨噬细胞产生和分泌脂氧素，促进炎症消退。促消退活动包括清除凋亡的中性粒细胞以及停止炎症信号等作用，起到避免炎症过度，从而降低瘢痕发生的可能。去年发表的一项研究表明 CaHA 和 PLLA 微球植入剂在植入大鼠体内后，微球促使机体分泌出各种炎症因子，刺激单核细胞向巨噬细胞的迁移分化以及促炎状态 M1 巨噬细胞的激活。ELISA 结果验证了 PLLA 组的炎症因子保持在相对较高水平，表明这些组中存在长期炎症和 M1 巨噬细胞的增加。相比之下，CaHA 组的炎症因子表达较低，其炎症反应与透明质酸（HA）相当。这个结论符合 CaHA 是无炎性机械转导再生。
正如上文所提到的，在炎症反应的早期阶段存在于外来物质周围和内部后，中性粒细胞会经历凋亡，并释放信号上调巨噬细胞吞噬相关基因表达，进一步促进 M1 巨噬细胞向抗炎 M2 巨噬细胞的转化（上图）。M2 与 M1 巨噬细胞的比例（即特征蛋白CD206与iNOS的比例）表明，CaHA 的植入诱导了更多的 M2 巨噬细胞参与抗炎反应。如下图所示，植入后 3 个月 TEM 结果表明，CaHA 组中的成纤维细胞广泛围绕着 CaHA 微球。这些成纤维细胞表现出良好的细胞骨架铺展、强壮的伪足以及染色质均匀分布的细胞核。细胞质中富含正常的细胞器，包括线粒体和粗面内质网。值得注意的是，嵌入微球中的胶原纤维显示出独特的条纹模式（如上图箭头所示），这是由更密集和较不密集的纤维区域交替形成的，呈有序“编织”状，是具有高级结构的天然胶原纤维的特征。无排列紊乱或过度交联的瘢痕胶原纤维特征。
除了 M2 巨噬细胞的“保驾护航”外，正如上文所说，不同的亚群的成纤维细胞可能对伤口瘢痕的贡献不同。如下图所示，来自不同解剖位置的各种成纤维细胞谱系，在机械信号和炎性巨噬细胞信号的介导下，参与伤口 ECM 的沉积。左图显示，小鼠背部皮肤中，真皮中的乳头状和网状成纤维细胞来源于不同的皮下前体细胞。右图显示，来源于皮肤中不同显微解剖位置的成纤维细胞参与了伤口愈合，但其中那些曾表达过 engrailed 1 （EN1）或 PRRX1 的成纤维细胞，往往倾向于促进瘢痕形成。关于瘢痕也可以参考我们上一篇文章：羟基磷灰石｜胶原的再生与过度再生。小鼠皮肤伤口愈合中的几项研究表明，成纤维细胞在皮肤伤口边缘的微观解剖位置是关键，较浅表的乳头状成纤维细胞参与较少，而较深的网状甚至皮下成纤维细胞主导早期的成纤维细胞涌入，这些细胞更容易形成瘢痕，因此注射深度是一个值得关注的因素。
此外，身体的总体解剖位置对瘢痕形成有不同的倾向性，有些高张力区域非常容易形成瘢痕，例如前胸、背、肩部，原因可能是成纤维细胞是主要的机械感应细胞，能够感知张力和基质硬度，分化为肌成纤维细胞，及后续过度合成胶原和ECM。而其他部位，最显著的是口腔，往往具有抗瘢痕性。真皮填充剂应用较多的面部不属于通常所说的“人体高张力区域”。
还有一个影响植入后 M1 还是 M2 的重要因素：微球的粒径和形状。我们曾用了多篇文章论述了形状和粒径的影响（点击阅读：羟基磷灰石形状 - 被忽视的属性HA搭配羟基磷灰石｜大粒径vs小粒径），当粒径＜ 6μm 时，IL-1β的表达量迅速升高，而＞30μm 时，IL-1β 表达量极低，说明粒径越小的 CaHA 微球越容易引起 M1 型的免疫应答，而表面的粗糙与否并不影响 M1 和 M2 的极化，但针棒状的 CaHA 会极高促进 IL-1β 的表达（促进 M1 极化）。有趣的是，当微球无法被单个巨噬细胞吞噬，巨噬细胞会融合形成异物巨细胞（FBGC），大部分情况 FBGC 是促炎的，但在 CaHA 周围，FBGC 反而通过分泌IL-4、IL-13等细胞因子，倾向于诱导 M2 型极化，而非持续释放 IL-1β。- 不同微球可能诱导不同亚型的巨噬细胞，从而产生从促炎到抗炎的不同结果；
M1 型巨噬细胞具有强杀菌活性、促炎；M2 则具有免疫抑制、组织修复功能。但 M2 并非全部抗炎，其中 M2b 亚型可分泌TNF、IL-6等促炎因子；
愈合过程中巨噬细胞表型是动态变化的：早期以 M1 为主（促炎、清除病原体），后期转化为 M2（抗炎、促修复），有利于避免过度炎症和瘢痕形成；
CaHA 相较于 PLLA 的炎症因子表达低，与透明质酸（HA）相当，且 M2/M1 比例升高，支持其“无炎性机械转导再生”；
CaHA 粒径和形状的影响：
请持续关注Herostem Lab汇融实验室及其下属单位BETAGENE Genetic贝融生物的研发进展，未来我们会继续关注羟基磷灰石、胶原蛋白与琼脂糖等新材料在再生医学、医美等多个领域的创新应用，并持续更新医用产品的相关研发进展。上海汇融细胞科技有限公司（HEROSTEM® LAB，汇融实验室®）位于上海·外高桥自贸壹号，已投入 GMP 运营并获得ISO9001与ISO13485的认证。汇融实验室于 2012 年成立，致力于细胞与基因工程技术在生命科学与生物美容领域的创新与探索，提供从研发到商业化生产的重组蛋白制剂、酶、医疗器械原料、药物原料与药物中间体。贝融生物作为医美领域专注于研发-License Out 的精品研发人（Boutique Innovator），陆续开发了包括胶原蛋白注射剂、可注射羟基磷灰石微球注射剂及微球原料、琼脂糖注射剂等创新产品。更多信息，请查看我们的官网：www.herostem.com.cn。
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