胶原，特别是 I 型胶原（COL I），为皮肤提供结构支持和拉伸强度。既往研究已证实，注射后 1 周，成纤维细胞围绕羟基磷灰石（CaHA）微球聚集，这些微球具有生物刺激效应，导致成纤维细胞产生胶原。检测通过 HE 染色显示，注射后 6 个月 CaHA 周围 COL I 和 COL III 沉积定性增加，在重塑过程中 COL III 逐渐被 COL I 替代，这与生理条件下的重塑和胶原产生过程一致，并且相比对照组，弹性蛋白表达水平和血管生成都更高。
然而凡事都有两面性，成纤维细胞作为细胞外基质（ECM）的主要构建者，特定成纤维细胞可能在某些因素下，如机械性激活驱动而调控再生细胞增殖行为，导致 ECM 的过度积累（即纤维化）而破坏组织结构，影响美学外观。
这种过度的胶原刺激，对比透明质酸钠的馒化（点击阅读：过度注射肿胀馒化的分析），有什么差异？胶原再生是不是有个安全阈值呢？超过了这个阈值，是不是会有严重的后果？胶原蛋白，是越多越好吗？
本篇文章灵感来自于吴东辉医生的专题分享。各位读者也可点击下方关注他的公众号，有非常多关于 CaHA 的分享与思考。
包括人类在内的哺乳动物通常通过纤维化疤痕来愈合伤口。当这种纤维化增生过度时，则在伤口处形成了瘢痕。近些年发表的研究揭示了导致皮肤损伤后疤痕形成和再生的细胞及分子机制，其中相关的通路并非孤立存在，而是相互关联的。瘢痕的特征是修复的伤口部位结缔组织中过量紧密交联的胶原纤维基质和低细胞密度。
微球过度注射后，是否会导致注射部位的“瘢痕”化呢？这是不是属于微球注射剂的“馒化”？
多项研究已证实，瘢痕组织中的瘢痕化胶原表现为纤维增生、组织结构紊乱、机械张力差。下图为通过HE染色（A、B）和Masson染色（C、D）观察正常皮肤和瘢痕的组织学结构（左侧正常，右侧瘢痕）。瘢痕组织由增厚的表皮和含有粗硬胶原纤维的真皮构成，其组织学结构与正常皮肤不同。E和F：正常皮肤和瘢痕组织表皮厚度的测量。**P < 0.01 vs. 正常皮肤。
在正常皮肤中，可以清晰观察到表皮、真皮及皮下组织的分层结构。表皮包含4至5层，其中的角质形成细胞在向外迁移的过程中增殖并逐渐成熟为棘细胞、颗粒细胞和角化细胞（图A和图C）。同时，在其下方的真皮中，成纤维细胞构成疏松结缔组织，其中富含平行排列的胶原纤维。
瘢痕组织的组织学结构与正常皮肤不同，表现为血供丰富、间质密度高以及表皮层增厚（图B和图D）。瘢痕真皮主要由排列紊乱的致密结缔组织构成，包含形态不规则、直径更大的粗硬胶原纤维。尽管在瘢痕表皮中可观察到多层角质形成细胞，但基底膜的组织学结构已发生改变。此外，瘢痕组织的表皮厚度明显大于正常皮肤。
当伤口源性的细胞因子和炎症信号触发成纤维细胞深度活化，即导致过度产生胶原蛋白和ECM过度沉积，遂引起胶原瘢痕化。因此，成纤维细胞是瘢痕形成和纤维化的关键下游介质，也是改善伤口愈合和纤维化结局的研究热点。
瘢痕疙瘩是一种以胶原蛋白（尤其是 I 型胶原）过度沉积为特征的常见纤维增殖性疾病，瘢痕疙瘩具有免疫炎症反应失调的特点。真皮层的慢性炎症通过增强成纤维细胞增殖、肌成纤维细胞激活以及上皮-间质转化，进而促进组织纤维化的进程。
皮肤的所有细胞谱系都需要参与修复过程，各种机械和化学信号触发这些协调的细胞行为。许多信号来自炎症细胞，它们本身被损伤信号以及它们主要被招募来抵御的病原体信号吸引到伤口处（下图左）。修复过程的某些过程是暂时和可逆的，例如伤口血管生成反应（下图中）；其他过程，包括瘢痕胶原的沉积（下图右），往往作为永久性结构留存下来，并且是伤口愈合病理的一部分。瘢痕疙瘩的HE染色显示，炎症程度从周边向中心递减，而玻璃样变胶原的分界增加。这些结果提示炎症参与瘢痕疙瘩形成。炎症的关键特征如微血管、成纤维细胞和淋巴细胞均从瘢痕疙瘩周边向中心逐渐减少，表明中心区域炎症减轻。这与先前研究一致，即瘢痕疙瘩周边区域以血管生成、成纤维细胞增殖和胶原产生为特征，而中央区域以缺氧、凋亡和丰富胶原为特征。瘢痕疙瘩成纤维细胞具有内在缺陷，表现出自主性和侵袭性行为。即使伤口愈合完成后，这些细胞仍持续增殖并抵抗凋亡，无法恢复组织稳态，以类似肿瘤的方式侵袭周围正常组织。过度增生的胶原与疤痕疙瘩本质即在于：瘢痕成纤维细胞是否有侵袭性。瘢痕成纤维细胞（Scar Fibroblasts / Keloid and Hypertrophic Scar Fibroblasts）是皮肤在遭受创伤后，在异常病理性愈合（如增生性瘢痕和瘢痕疙瘩）过程中处于核心地位的一类特殊表型成纤维细胞。正常情况下，成纤维细胞在伤口愈合后会逐步通过凋亡（细胞程序性死亡）减少。但在病理性瘢痕中，这类细胞发生了“表型转化”，表现出极强的过度增殖和 ECM（尤其是胶原）沉积能力。
成纤维细胞是瘢痕形成的核心执行者。它们并非单一细胞类型，而是由具有不同功能的多个亚群组成。这些亚群在胚胎起源、真皮层次定位、基因表达谱和功能特征方面存在差异，其中间充质型成纤维细胞是瘢痕疙瘩形成的主要促成因素。
含有丰富具长突起的成纤维细胞、附着细纤维状胶原的真皮结节传统上被认为是增生性瘢痕的组织学特征，且在瘢痕疙瘩中不存在。但近期有研究发现，部分瘢痕疙瘩样本中发现了含玻璃样变胶原的真皮结节。瘢痕疙瘩的特征从中心向周边似乎存在转变，表现为结节大小和细胞性增加、结节轮廓界定更差、胶原数量和厚度减少（如上图所示，A为全景，40×；B为周边区域局部放大，40×；C为中央区域局部放大，100×）。
基于这一组织学分析，可以推测增生性瘢痕和瘢痕疙瘩可被视为同一纤维增殖性皮肤疾病的连续阶段，具有不同程度的炎症。纤维增殖以间充质细胞及其结缔组织产物的积累为特征；而炎症程度决定了疾病的性质。
虽然瘢痕疙瘩是一种具有遗传易感性的疾病（发病率约为4.5%~16%），但所有病理性瘢痕的形成均涉及成纤维细胞功能障碍引起的ECM 代谢失衡，多条信号通路（如下文将介绍的Col1-DDR1、IL-6/JAK/STAT3、TGF-β/Smad等）的异常激活、表观遗传调控以及生物力学等也是不容忽视的因素。因此在过度使用微球注射剂之前，可以优先判断求美者是否为瘢痕类体质，这有助于降低其注射区过度增生甚至瘢痕化的风险。
如上所述，瘢痕的主要特征之一是胶原蛋白过度沉积，胶原蛋白信号参与了伤口愈合的所有关键阶段。盘状结构域受体1（DDR1）转运至成纤维细胞的质膜（细胞膜），会通过与 I 型胶原蛋白结合来促进纤维化 。在正常皮肤中，真皮成纤维细胞中 DDR1 的表达水平较低或呈不连续分布，而在瘢痕疙瘩成纤维细胞中则表现出较高水平的 DDR1 表达。那么 DDR1 很可能是导致瘢痕胶原的重要因素之一。
DDR1 的激活和酪氨酸自磷酸化需要通过与胶原蛋白结合来驱动。研究表明 DDR1 需要与一种 GTP 酶 - ARF6 相互协同作用，从而增强了I型胶原蛋白诱导的 DDR1 激活，因为 ARF6 介导了 DDR1 在细胞表面的膜分选。瘢痕疙瘩组织表现出过度的胶原蛋白沉积，但如此强烈的胶原信号在瘢痕疙瘩炎症发展中的具体作用尚不明确，也不明确究竟是 I 型胶原的积累，还是 ECM 的重塑和蛋白水解状态，促进了瘢痕疙瘩中的 DDR1-NF-κB/STAT3 信号传导。
如下图所示，瘢痕疙瘩中的角质形成细胞和成纤维细胞均高度表达磷酸化的 DDR1、CCL2 和 IL-6。作为介质导基质-上皮相互作用并激活成纤维细胞的桥梁，DDR1 的调控失常就会导致纤维化的发生。CCL2 和 IL-6 作为经典的促炎因子，进一步招募免疫细胞并维持慢性炎症状态，从而继续激发了瘢痕形成，这一过程也可称为“炎症放大器”。错误使用面部再生产品导致的皮肤硬化，很可能也有炎症放大器的参与。
STAT 信号通路的激活，特别是转录激活因子3（STAT3）的激活，代表了上文中炎症放大器的因子（如 IL-6、IL-17）和促纤维化信号传递的关键枢纽。IL-6 在瘢痕组织中呈高表达。IL-6 与其特异性受体结合后，启动 Janus 激酶（JAK）家族成员的活化。随后，JAK 激酶磷酸化并激活信号转导与 STAT3。活化后，STAT3 二聚体发生核转位，作为转录调节因子启动其下游靶基因的转录。IL-6/JAK/STAT3 信号轴协同增强胶原生物合成、促进细胞外基质（ECM）沉积、刺激成纤维细胞进入活跃细胞周期以促进增殖，并诱导上皮-间充质转化（EMT），从而可能促进额外肌成纤维细胞的生成。Th17 来源的 IL-17 在瘢痕组织中表达升高。该细胞因子可直接或间接（通过诱导 IL-6 产生）激活 STAT3。IL-6 和 IL-17 建立正反馈环路，相互增强表达并维持 STAT3 的活化，从而放大炎症和纤维化信号通路。
此外，如上图所示，DDR1 磷酸化促进了其与 STAT3 的相互作用，导致 STAT3 磷酸化增加。瘢痕疙瘩的角质形成细胞和成纤维细胞高表达 CCL2 和 IL-6，进而促进免疫细胞的募集并维持炎症。
TGF-β/Smad 信号通路是目前关于驱动病理性瘢痕发展，研究最为深入的通路。我们先前的文章曾对TGF-β通路进行过详细介绍，推荐阅读：TGF-β｜羟基磷灰石再生的另一条通路。其持续性激活导致成纤维细胞和肌成纤维细胞长期过度活化，是胶原过度合成和积累的主要驱动力。位于质膜上的 II 型受体首先被 TGF-β 配体靶向，随后 I 型受体（主要为 ALK5）被募集并磷酸化，形成活化的受体复合物。活化后，I 型受体磷酸化 Smad2 和 Smad3，后者在结合后形成与 Smad4 的复合物。这些磷酸化的 Smad2/3-Smad4 复合物转位进入细胞核，作为转录调节因子特异性识别并结合启动子元件（如胶原基因启动子内的 CAGACA 基序），从而启动靶基因的转录。活化的 Smad 复合物直接上调 I 型和 III 型胶原（瘢痕中 ECM 的主要成分）的转录表达。此外，TGF-β/Smad 通路诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞分化。肌成纤维细胞表现出 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达，具有强大的收缩能力和升高的胶原分泌水平，共同导致组织挛缩和纤维化进展。
除了上述提到的信号通路，与病理性瘢痕形成相关的通路还包括 Hippo/YAP、整合素/FAK/Rho GTPase、c-JUN/PI3K/AKT及Wnt/β-catenin等，篇幅所限，暂不一一说明。
我们之前也讨论过 CaHA 导致的面部纤维化（点击阅读：羟基磷灰石过量注射可导致皮肤纤维化？），那么过度注射微球注射剂是否会导致瘢痕疙瘩呢？事实上，病理学家几乎不会用瘢痕疙瘩来形容微球注射后导致的胶原过度增生（尤其是结节）。因为瘢痕疙瘩是一种内源性、与基因易感性相关的成纤维细胞过度活化，表现为成束的、粗大的、玻璃样变性的胶原纤维（Keloid collagen）呈漩涡状排列，且不含异物。
临床医师反馈过，有些病人使用过一次或多次微球填充剂后随访，注射部位有明显的硬物感，甚至难以再进行补充注射，怀疑是微球导致的过度刺激。这类微球引起的过度增生被称为“包囊化纤维化”或“透明样变性”。在晚期结节或永久性植入剂微球周围，巨噬细胞和成纤维细胞会分泌大量致密的胶原，将微球彼此推开（如下图，注射至皮下的 CaHA 微球之间产生大量的胶原纤维）。
微球注射剂的结局是无序的瘢痕还是可控的再生，这取决于信号通路之间平衡。但上述这些信号如何在空间和时间上被精细调控以协调再生或疤痕形成，目前学术界仍未完全厘清。不过正如上文提到的“炎症放大器”——DDR1 通路机制，可以确定的是，过度或长持续时间的炎症，是驱动慢性和破坏性病理性瘢痕的基础因素。
我们知道生物刺激剂植入体内会触发适应性免疫反应，在机体识别外来物质后，植入物会被中性粒细胞浸润，触发急性炎症。这一过程中，免疫应答也扮演着重要作用。受篇幅所限，我们未来会更系统地研究微球植入后免疫应答，特别是 M1 和 M2 型巨噬细胞在再生过程中扮演的角色。上述分析均提示生物刺激剂，尤其是 CaHA 微球在规范注射和规定剂量下引起瘢痕的可能性很低，但现实中，亦有少数报道记录在已上市 CaHA 注射填充剂导致的炎症性并发症。
一名51岁女性因左侧下唇黏膜侧肿块到德克萨斯大学圣安东尼奥健康科学中心口腔医学诊所就诊。实际病变为一个6 × 3毫米的黄色结节，边界清晰、形状不规则，触诊质硬。患者六周后复诊行活检。此次就诊时，医师在下唇右侧和左侧唇红缘发现两个新的2-3毫米病变（下图，白色箭头）。患者补充病史包括既往曾接受医美填充剂注射，使用的材料为CaHA。
下唇左侧麻醉后，医师沿唇黏膜侧做1厘米浅表切口，暴露病变。覆盖的黏膜和结缔组织外观正常，医师通过钝性分离进行切除活检。病变与周围结缔组织相连，切除肿块呈淡黄色，质地似橡胶。最终组织学诊断为软组织中存在异物，伴明显的异物巨细胞反应、慢性炎症和纤维化。
作者分析认为，在本病例中，持续性结节发生于黏膜下口内位置，是由于材料放置过深所致。微观解剖位置是形成瘢痕的一个关键因素，临床操作中应避免将填充物植入过于深入的位置。对于已出现纤维化的持续性结节，除手术外，也可以使用蛋白酶注射和各类物理疗法处理症状较者。胶原酶是一种最有效的蛋白酶，能够分解胶原蛋白中的肽键。
关于抑制瘢痕形成，近期有学者通过研究成年小鼠指端截肢后的伤口愈合，调查了组织物理环境与再生性结局相对于纤维化结局之间的关系。结果提示再生区域柔软且富含透明质酸（HA），而耗竭 HA 将抑制再生，并促进纤维化（诱发纤维化样 ECM），表明 HA-胶原平衡可塑造组织力学和修复信号。如下图所示，比较了透明质酸酶处理（右图）与对照小鼠指端的胶原基质。透明质酸酶处理导致出现杂乱纤维化结构特征，提示 HA 耗竭时出现的纤维化胶原会改变组织的力学特性，进而导致纤维化样 ECM。
在非再生性截肢后，用透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1（HAPLN1）可稳定 HA，达到调节 ECM 力学、减少瘢痕并增强骨修复。总之，稳定的 HA 水平或可预防 ECM 纤维化样，那么在皮肤填充剂领域，CaHA+HA 是否能达到 1+1 > 2 的效果？这个配方近年来随着 HArmonyCa 的获批变得非常流行。我们也期待 HA+CaHA 类产品更多的研究。回答文章前面问题：对于 CaHA 注射剂来说，过度的胶原刺激表现应该伴随 CaHA 周围有明显的巨噬细胞浸润。在结节病例中，微球之间不是疏松的结缔组织，而是被高度致密、排列混乱的胶原纤维网牢牢锁死，形成硬节甚至结节。
我们认为，过度刺激的本质就是机体对无法及时降解的微球产生了物理性包裹闭锁反应，成纤维细胞在异物刺激信号下，无休止地堆砌胶原，最终在微观上呈现出一片杂乱胶原网络，将微球孤立起来。这也就是为什么临床上这些结节触之极硬、且常规溶酶无法溶解的原因。因此，根据个人体质的定量、定部位注射，就变得尤为重要。请持续关注Herostem Lab汇融实验室及其下属单位BETAGENE Genetic贝融生物的研发进展，未来我们会继续关注羟基磷灰石、胶原蛋白与琼脂糖等新材料在再生医学、医美等多个领域的创新应用，并持续更新医用产品的相关研发进展。上海汇融细胞科技有限公司（HEROSTEM® LAB，汇融实验室®）位于上海·外高桥自贸壹号，已投入 GMP 运营并获得ISO9001与ISO13485的认证。汇融实验室于 2012 年成立，致力于细胞与基因工程技术在生命科学与生物美容领域的创新与探索，提供从研发到商业化生产的重组蛋白制剂、酶、医疗器械原料、药物原料与药物中间体。贝融生物作为医美领域专注于研发-License Out 的精品研发人（Boutique Innovator），陆续开发了包括胶原蛋白注射剂、可注射羟基磷灰石微球注射剂及微球原料、琼脂糖注射剂等创新产品。更多信息，请查看我们的官网：www.herostem.com.cn。
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