近期，我们在一个视频中发现了很有趣的主题讨论：
巨噬细胞极化、成纤维细胞行为、组织修复效果、细胞毒性及生物利用度等方面都影响了临床使用效果，而它们也受胶原的来源（重组 vs 动物组织提取）、胶原类型（I 型 vs III 型 vs 混合型）、胶原蛋白含量、生产工艺等多种因素的影响。
引用博主的视频来说，重组胶原的胶原含量多为 4-16mg 的区间，和动物源动辄 35-45mg 的含量相比，这个差异可能导致了一个常见的认知 - 即“胶原蛋白浓度越高，效果越好”。
这种线性关系是否符合生物学事实？动物组织胶原蛋白的高浓度是否能解释两者在临床上的效果差异？胶原蛋白，含量是越高（低）越好吗？
我们仅从细胞-基质相互作用的维度，集中探讨胶原蛋白浓度（及其带来的微环境密度与刚度变化） 如何影响再生效果。是否存在一个最优的浓度/刚度区间，在此区间内组织修复信号被最大化激活，而过度纤维化或慢性炎症的风险则被有效抑制？需要说明的是，我们仅聚焦于胶原蛋白含量这一变量，暂不展开讨论蛋白来源（重组 vs 动物源）、生产工艺或高级结构等因素的影响。
胶原蛋白纤维密度的变化能够显著影响巨噬细胞的表型、细胞因子分泌以及它们在单核细胞浸润和成纤维细胞分化中的功能。这意味着，并非简单地“高密度=好”或“低密度=差”，而是存在一个最优密度区间，在该区间内巨噬细胞可被引导向促修复的M2型极化，而非促炎的M1型。
巨噬细胞是重要的先天免疫细胞，具有极强的可塑性，这使它们能够有效应对其微环境中的促炎和抗炎信号（点击阅读：羟基磷灰石｜巨噬细胞的极化和炎性）。
传统上，巨噬细胞表型通常通过简化分类法分为两类：
然而，这种简化的命名法可能会使人误以为巨噬细胞亚群具有同质性（homogeneity），但实际上这种同质性在体内并不存在，因为这两种细胞都能根据微环境信号表现出从促炎到抗炎的表型来回变化，从而承担不同功能。
“同质”即“相同的性质”。在生物学或统计学中，如果一群细胞具有同质性，意味着它们在形态、功能、基因表达和表型标志物上都高度相似，可以被视为一个整齐划一的“标准件”群体。
通过上述可以推导：当胶原能够促进巨噬细胞向 M2 分化，则可以促进组织修复（再生）。因此我们可以研究胶原蛋白浓度与免疫细胞极化的关系，有助于我们理解巨噬细胞如何在不同纤维密度环境中进行调节，以及它们如何分化并活化成特定亚型，从而评价胶原浓度和效果的关系。
研究表明，在生理和病理过程中，组织/胶原纤维密度的动态变化和可能显著调节巨噬细胞的活化及其细胞功能。这在组织修复过程中尤为重要，因为此时组织密度会从疏松状态变为致密状态。为了探究其中的机制，研究使用浓度为 1mg/mL 和 3mg/mL 的胶原基质来模拟组织密度的差异。
由于人类THP-1细胞衍生的巨噬细胞与天然的单核细胞源性巨噬细胞极为相似，因此选用其作为研究对象。单核细胞首先侵入组织，随后在微环境信号的影响下活化成特定类型的巨噬细胞。为了在体内模拟这一过程，研究将THP-1细胞嵌入三维胶原基质中，使其分化并活化（如下图）。
结果显示，THP-1细胞被嵌入到结构明确的三维胶原基质中，分化并激活为特定的巨噬细胞亚型：MPMA、MLPS/IFN-γ 和 MIL-4/IL-13 （前者通过添加）。与 MPMA 和 MIL-4/IL-13 相比，MLPS/IFN-γ 在蛋白质水平（如下图左）显著表现出更高的 MHC-II（MHC-II 的上调常被用作促炎性抗原呈递细胞增强炎症活性的指标）表达。但并不会因为胶原浓度更高而表达更多的 MHC-II。
激活方法：MPMA - 添加 PMA，使其最终分化为未定向巨噬细胞；MLPS/IFN-γ - 添加 LPS和 IFN-γ；MIL-4/IL-13 - 添加 IL-4 和 IL-13。
在基因水平上，高浓度的胶原却能提升 MHC-II 的表达量（下图左），这一现象在 MLPS/IFN-γ 中尤为显著。胶原变得更密集，只能在基因层面提升 MHC-II，却不体现在蛋白质层面，说明 MHC-II 还受更多的通路共同影响（例如p38 MAPK）。
在 MIL-4/IL-13 组中可以观察到 CD163 基因表达的显著差异（下图右），且该表达似乎还受组织密度的影响：基质硬度越高，MIL-4/IL-13 组中 CD163 的表达水平就越高。这个结果与以往关于 THP-1 来源巨噬细胞上 CD163 表达情况的研究结果不一致。之前有些研究（多为二维培养）无法检测到 CD163，或者促炎性和抗炎性巨噬细胞的 CD163 的表达并无显著差异。此外，外周血单核细胞来源的巨噬细胞表面几乎检测不到 CD163。
胶原基质变得致密后可以上调 CD206 基因表达（上图右）。CD206 对细胞微环境很敏感，因此胶原的浓度影响了所有的亚型的 CD206 基因。CD206 通过其受体上的Ⅱ型纤连蛋白结构域 （fibronectin type II domain）促进细胞与胶原的粘附，同时参与胶原的降解过程，这是不是说明当胶原过量补充时，巨噬细胞会去降解过度致密的胶原？也就是说，胶原的再生是动态平衡的。
各种巨噬细胞亚型会产生的细胞因子，这些细胞因子除了作为巨噬细胞的激活状态外，还会进一步作用于其他细胞，从而影响临床效果。如下图所示，MLPS/IFN-γ 分泌的 IL-1β 和 TNFα 水平更高。MPMA 和 MIL-4/IL-13 所分泌的细胞因子高度相似，但前者不表达 IL-8。
在去除巨噬细胞激活剂（前文中 PMA、IL-4、IL-13、LPS、IFNγ等）并置于新鲜细胞培养基中培养3天后，所有巨噬细胞的 IL-10、IL-12 和 TNFα 均无法被检测到。MLPS/IFN-γ 释放的IL-1β 最多（上图A）；MIL-4/IL-13 表达 IL-6 最多。IL-6兼具促炎与抗炎作用，还具有促血管生成和修复功能。在所有巨噬细胞亚型中，IL-6的生成量在去除激活剂后便增加了：这说明在去除炎症刺激因素后，IL-6 的存在有助于进一步清除伤口部位的凋亡细胞或碎片，同时促进修复所需的血管生成及胶原蛋白合成。
对于所有细胞因子而言，其分泌水平都依赖于纤维密度。无论是否存在激活剂，在更高浓度的胶原中，所有巨噬细胞亚型的多数细胞因子分泌都会增加。这是不是说明了高浓度胶原反而促进了炎症因子的产生呢？这会不会是因为人源巨噬细胞对异种的胶原产生了反应？改用人源化的胶原是否会不一样呢？
另一项研究发现，与未经处理的胶原基质相比，经预先激活的 PBMC 源性巨噬细胞在交联的胶原基质中分泌的促炎细胞因子减少，交联后的胶原蛋白显著增加 IL10 分泌和 IL10/IL12 比值，下调 IL12 和 TNFα（如上图，coll 为非交联组，EDC 为交联胶原组）。这说明胶原的刚性（交联的胶原刚性更高）会让巨噬细胞从 M1 向 M2 型极化，即越硬、越致密的胶原越能够抗炎。然而这个抗炎效果会被 GAG（糖胺聚糖，上图 HA 和 sHA 组）所中和，使巨噬细胞维持在炎症状态。这是不是代表纯胶原比 细胞外基质（ECM，比胶原多了其他基质成分，包括GAG）更能够抗炎？
在三维细胞培养中由 THP-1 衍生的巨噬细胞所释放的细胞因子具有纤维密度依赖性。如前文所述，胶原的再生是动态平衡的，胶原基质虽然促进了 M2 亚型巨噬细胞的极化，从而启动伤口愈合和再生的机制，但高浓度的胶原也会促进 CD206 的表达，参与胶原蛋白的降解。在组织再生阶段，成纤维细胞在 TGF-β1 存在下分化为肌成纤维细胞（点击阅读：TGF-β｜羟基磷灰石再生的另一条通路）。TGF-β1是成纤维细胞分化的先决条件，而巨噬细胞分泌 TGF-β1 也受胶原蛋白基质密度的影响。让人惊讶的是，反而是较低的胶原密度提高了所有巨噬细胞中 TGF-β1 的分泌（如下图 A），虽然这个低浓度胶原对 MIL-4/IL-13 的表达 TGF-β1 的影响更低，但 MIL-4/IL-13 的 TGF-β1 整体分泌量远高于 MPMA 和MLPS/IFN-γ，说明 MIL-4/IL-13 可能是触发成纤维细胞分化的决定因素，而且肌成纤维细胞会额外分泌 TGF-β1 以维持成纤维细胞分化。
α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）是肌成纤维细胞标志物，在与 MIL-4/IL-13 共培养的成纤维细胞中可发现 αSMA 增加，但在 MPMA 和 MLPS/IFN-γ 共培养中则未发现（如上图C）。αSMA的表达仅来源于肌成纤维细胞，因为巨噬细胞中不表达 αSMA。需要注意的是，αSMA 表达随纤维密度增加而降低。这正和上段中低浓度胶原反而促进了 TGF-β1 的表达相符：高密度胶原 →TGF-β1降低→αSMA 降低→肌成纤维细胞降低。由于肌成纤维细胞会大量产生基质蛋白。如上图 D、E 所示，Coll1a1（I 型胶原α1基因）和 EDA-FN（纤连蛋白）随 αSMA 上调而共同上调。同样，随着纤维密度增加，两种基质蛋白均有轻微降低。上面数据说明高浓度胶原基质似乎抑制了肌成纤维细胞分化。这表明在生理条件下，致密纤维基质可能充当肌成纤维细胞的负反馈信号，以防止基质蛋白过度产生和重塑（和 CD206 类似），再一次说明：胶原再生是动态平衡。
人类真皮成纤维细胞（HDFs）通常静止不动，而肉芽组织中的成纤维细胞则具有增殖和运动能力。细胞与 ECM 的相互作用产生两种不同但同时发生的信号机制：依赖于 ECM 表面化学的配体诱导信号和依赖于通过ECM传递的机械刺激的牵引诱导信号。早期研究显示，培养在低密度胶原水凝胶中的成纤维细胞会收缩基质，形成更致密的“组织形态”的结构。当凝胶机械固定于刚性容器时，细胞产生等长张力，随着基质刚度增加，细胞经 4 天滞后期后开始增殖，倍增时间为 6 天；而相同凝胶在未附着、自由漂浮状态下则几乎不增殖，且有显著细胞凋亡（如下图）。在0.2%、0.4%、0.7%胶原密度（浓度和刚度递增）中，细胞增殖率呈梯度升高（如下图），在 2 天和 6 天的培养中，细胞和胶原存在连续的刚度-增殖线性关系。而 0.4% 至 0.7% 的胶原浓度差异不大，即使刚度在生理范围内小幅变化（42 至 143kPa），增殖率也有显著差异，说明细胞对硬度变化非常敏感。在前述THP-1来源巨噬细胞模型中，更高浓度的胶原基质普遍提升了多数细胞因子的分泌水平（包括促炎因子如TNFα）。然而在 PBMC 模型中，交联后刚性增强的胶原基质，显著提高了IL10/IL12比值（即抗炎/促炎比值上升），同时下调了 IL12 和 TNFα 的表达，表明刚性增加驱动了向 M2（修复型）的极化。这两个结论仿佛是矛盾的。
这可能是因为：
胶原浓度/密度 ≠ 胶原刚度：高浓度胶原可能促进了自平衡开关，让巨噬细胞启动胶原的降解；高刚性胶原促进巨噬细胞修复，释放 TGF-β1，进一步提升胶原合成；
细胞来源差异：THP-1是永生细胞系，其信号通路可能放大了对密度的应激反应；原代PBMC来源的巨噬细胞可能更接近体内真实反应；
极化标志物与细胞因子分泌是不同层面的读数：CD163/CD206上调（表型极化）与TNFα分泌（功能输出）并不一定同向变化，这在巨噬细胞可塑性研究中是常见现象。
综合以上信息，我们可以得出结论：胶原蛋白的效果差异，不仅是浓度，还和其刚性有关系。通常来说，高浓度也代表高刚性，但也可以通过造粒/交联工艺来得到柔软的高浓度低刚性/低浓度高刚性的胶原蛋白。在过低密度区间（如自由漂浮的低浓度凝胶），成纤维细胞因缺乏力学支撑而停滞于G₀期，细胞凋亡增加，修复信号微弱；
在适中密度区间，基质提供适度的力学感知信号，驱动巨噬细胞向M2修复表型倾斜（分泌TGF-β1），激活成纤维细胞进入增殖周期，启动有序的组织再生。
在过高密度区间（如致密纤维网络），虽然初期支撑效应显著，但生物学上会触发多重负反馈机制以限制过度纤维化，包括：CD206上调，启动胶原降解程序；肌成纤维细胞分化受抑（αSMA、Coll1a1表达随密度升高而下降）；巨噬细胞TGF-β1分泌反而减少。
遗憾的是，上述结论全部来自于细胞实验，而从细胞实验的浓度推导出临床的最优浓度几乎是不可能的。胶原蛋白仍需要大量的临床研究（包括动物实验）的共同参与。但我们可以至少得出一个结论：从细胞生物学视角回答“胶原浓度越高越好吗”这一命题，答案是否定的。
临床填充效果的最优化，并非指向“最高浓度”这一极值，而应指向“能最大化激活促修复信号、同时避免过度激活负反馈调节”的适宜浓度/刚度区间。这一区间取决于注射部位的组织力学环境、预期修复周期以及与其他ECM成分（如GAGs）的交互作用。
请持续关注Herostem Lab汇融实验室及其下属单位BETAGENE Genetic贝融生物的研发进展，未来我们会继续关注羟基磷灰石、胶原蛋白与琼脂糖等新材料在再生医学、医美等多个领域的创新应用，并持续更新医用产品的相关研发进展。上海汇融细胞科技有限公司（HEROSTEM® LAB，汇融实验室®）位于上海·外高桥自贸壹号，已投入 GMP 运营并获得ISO9001与ISO13485的认证。汇融实验室于 2012 年成立，致力于细胞与基因工程技术在生命科学与生物美容领域的创新与探索，提供从研发到商业化生产的重组蛋白制剂、酶、医疗器械原料、药物原料与药物中间体。贝融生物作为医美领域专注于研发-License Out 的精品研发人（Boutique Innovator），陆续开发了包括胶原蛋白注射剂、可注射羟基磷灰石微球注射剂及微球原料、琼脂糖注射剂等创新产品。更多信息，请查看我们的官网：www.herostem.com.cn。
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