既往研究发现，含钙类的微球可通过释放离子以增强 ECM 沉积来促进皮肤再生。体外研究表明，钙离子可诱导巨噬细胞向 M2 表型极化并刺激成纤维细胞迁移，从而增加蛋白质和细胞因子的分泌。钙（Ca²⁺）离子等多价阳离子的释放有助于调节局部 pH 值，可能对抗微环境中的酸中毒。Ca²⁺ 的存在还可增强含细胞在微球上的黏附。
在生物学效应方面，Ca²⁺ 在调控 PDLIM5 中发挥重要作用（PDLIM5 是一种促进激酶活性的必需衔接蛋白）。既往 PDLIM5 敲除实验已证实，PDLIM5 对成纤维细胞增殖和迁移至关重要，Ca²⁺ 可能通过促进 PDLIM5 介导的信号传导来增强这些细胞行为。Ca²⁺ 在促进皮肤再生中的功效及潜在机制还有哪些呢？这次我们用另一个思路探索钙离子的功能：不用 CaHA 做钙离子的研究，而是将 PLLA 中引入钙离子，再对比不含钙离子的纯 PLLA 的再生功能。首先制备五种微球：PLLA微球、PLLA/BG（1%）复合球、PLLA/BG（2.5%）复合球、PLLA/BG（5%）复合球、PLLA/BG（7.5%）复合球和PLLA/BG（10%）复合球，其中 BG 是含有钙离子的生物玻璃。如此一来，PLLA 就具有了 CaHA 才有的释放钙离子的功能了。PLLA 的优势在于其优越的球形度（上图左），超过 CahA 的球形度，PLLA/BG（1%）、PLLA/BG（2.5%）、PLLA/BG（5%）、PLLA/BG（7.5%）均呈相对规则的球形，而PLLA/BG（10%）球形度差一些，表明过高的 BG 含量会损害形态完整性，但由于 BG 里面除了钙离子，还有其他成分，这些成分具体哪个影响了球形度还需更多的研究。此外，粒径分析显示所有组均呈正态分布，PLLA/BG（7.5%）表现出最集中的尺寸分布（上图右）。
使用 NIH3T3 成纤维细胞迁移实验表明，与 PLLA 和 PLLA/BG（1%）、PLLA/BG（2.5%）、PLLA/BG（5%）复合微球相比，PLLA/BG（7.5%）显著增强了细胞迁移（上图）。
通过流式细胞术使用CD206（M2标志物）评估极化状态发现：巨噬细胞向 M2 表型分化。而且随着 BG 含量越高，微球逐渐诱导 CD206 阳性细胞比例增加。其中 7.5% BG 含量的微球显著增加了 CD206 阳性细胞的比例。下图为优化后的 PLLA 和PLLA/BG（7.5%）微球呈球形形态，尺寸分布相当，范围为20-60 μm。
体外降解结果显示，PLLA 的降解产生酸性产物，主要是乳酸及其低聚物，可降低周围介质的局部 pH 值。相比之下，PLLA/BG 随着 Ca²⁺ 等多价阳离子的释放，显著缓解了这种酸化情况。如下图所示，钙离子和硅离子将降解介质的 pH 值转向弱碱性条件，达到约pH 7.7（这可能是由于 BG 里面含有 CaO，逐渐释放出来遇水形成 CaOH），而纯 PLLA 则未观察到 pH 的显著升高。下图还展示了 PLLA/BG 微球中 Ca²⁺ 和 Si⁴⁺ 的累积离子释放浓度曲线，两种元素的释放速度是接近的。
通过 RT-qPCR 评估成纤维细胞的基因表达发现：与空白组相比，PLLA 和 PLLA/BG 复合微球均显著上调成纤维细胞的 COL1 和 COL3 基因的表达。值得注意的是，PLLA/BG 诱导了更强的反应，COL1 和 COL3 分别增加了 3.34 倍和 3.93 倍，而 PLLA 为1.83倍和2.06倍（如下图）。成纤维细胞通过合成和协调关键 ECM 成分（包括胶原蛋白、纤连蛋白、弹性蛋白、蛋白聚糖和其他结构蛋白）在皮肤稳态中发挥核心作用。这个结果充分说明了钙和其他离子更有助于微球促使细胞合成 ECM。
与基因表达数据一致，如下图所示，免疫荧光染色显示两种微球在培养3天后均促进了胶原蛋白I、胶原蛋白III和纤连蛋白的大量沉积。另一方面，基质金属蛋白酶（MMPs），特别是 MMP1 对 ECM 的降解是皮肤衰老的关键影响因素。与空白组和 PLLA 相比，PLLA/BG 有效抑制了MMP1的上调，从而阻碍了 ECM 的降解水平。这种抑制作用在蛋白水平也得到了证实（下图）。这些结果表明 PLLA/BG 可以通过增强关键结构蛋白的合成同时抑制其降解，积极促进 ECM 的沉积，突出了其对抗年龄相关 ECM 改变的潜力。转化生长因子-β（TGF-β）是胶原再生中关键调节因子（点击阅读：TGF-β｜羟基磷灰石再生的另一条通路）。与空白组相比，PLLA 和 PLLA/BG 分别将 TGF-β1 基因表达上调 1.39 倍和 2.57 倍（下图）。这与我们之前文章中结论一致。微球能够被巨噬细胞吞噬，并通过吞噬作用在细胞内进一步降解，释放 Ca²⁺ 和 PO₄³⁻ 离子。相应地，电子显微镜分析在6个月时确认了与钙一致的细胞内和细胞外物质的存在，微球被组织巨噬细胞吞噬。不溶的 Ca²⁺ 离子随后要么扩散，要么被主动运输出细胞进入周围介质，局部 Ca²⁺ 浓度的增加可以通过 TRPV4 通道直接影响成纤维细胞（点击阅读：羟基磷灰石过量注射可导致皮肤纤维化？）。如前文所述，钙离子可诱导巨噬细胞从 M1 表型向 M2 表型的转换，而且钙离子浓度越高，M2 分化越明显。如下图所示，PLLA 和 PLLA/BG 都能够降低 CD86（M1 标志物）阳性细胞的比例（分别为51.7%和51.8%）。PLLA/BG 显著增加了 CD206 阳性细胞的比例（64.4%），而 LPS 组和 PLLA 的比例则低得多（分别为19.9%和28.7%）。
由于 M1 型细胞减少了，M1 的相关基因（Nos2和IL-1β）也降低了（下图），同时M2相关基因（Arg-1和Ccl17）上调了。这些结果清楚地表明，离子是有助于促进巨噬细胞极化从促炎 M1 状态向促再生 M2 表型的转变，这给内卷微球商品们指了一条新方向 - 钙离子改性。钙离子也增强了 IL-10 和 TGF-β 等细胞因子的分泌，这些细胞因子反过来促进成纤维细胞向 Ca²⁺ 浓度升高的区域迁移。这种迁移使得成纤维细胞转变为肌成纤维细胞，进而积极参与细胞外基质的重塑。既往研究已证实 PDLIM5 通过 Ca²⁺ 介导的机制参与各种细胞功能。与单独 PLLA 微球相比，PLLA/BG 显著提高了 PDLIM5 的基因和蛋白水平表达，如下图所示，说明钙离子确实有助于提升 PDLIM5 的表达。之前研究表明 PDLIM5 与 ECM 的主要成分（如胶原蛋白和纤连蛋白）的表达密切相关，可能促进 TGF-β1 信号传导。Western blot分析证实了这个结论：抑制 PDLIM5 可以显著降低 TGF-β1 和 III 型胶原蛋白的表达（如下图）。免疫荧光染色验证了 PDLIM5 表达的降低，并显示下调的 PDLIM5 也抑制了 I 型胶原蛋白、III 型胶原蛋白和纤连蛋白的合成。结合上文，钙离子则是通过提升 PDLIM5 的表达来帮助各类微球（包括 CaHA）来促进 ECM 的重建。由于 BG 里面还含有硅离子，那么是否也考虑硅改性的微球呢？我们认为如果用于开发医美产品的话，还是尽量选择钙离子。有研究表明硅离子可能上调MSC 的 RUNX2 基因，促使干细胞向骨细胞分化，而随着硅比例降低、钙比例升高，RUNX2 基因是下调的。这说明过多的钙离子是抑制干细胞向骨细胞分化的。蛋白冠是当颗粒/微球进入生物环境后，发生蛋白吸附所形成的最终动态界面结构，具体来说，是在生理环境（如血液）中，大量不同蛋白质竞争性吸附在微球表面，最终形成的一个多层、动态的蛋白质吸附层。CaHA 微球有明确的蛋白吸附能力，归结于其正负电荷以及极高的比表面积，因此也经常被作为蛋白质层析填料使用。
蛋白冠不仅展示了蛋白吸附效果，而主要在于揭示了这种吸附的生理学结果：它会完全改变颗粒的表面特性，从而影响微球在体内的识别、分布、清除和毒性（即生物学身份）。
由于蛋白冠的形成是一个动态过程（Vroman效应），短期（5分钟）与长期（1小时）时生物玻璃（硅和钙的合成物）表面形成的蛋白冠（上图）就具有差异，尽管这种变化细微，然而这一结果表明，孵育时间可能对植入的材料所引发的免疫反应产生影响，因为蛋白质冠的组成决定了免疫系统对这种颗粒的识别。这可能也解释了一些 CaHA 微球在注射之后产生的迟发性肿胀（形成了蛋白冠后引起了免疫反应）。
增加 Ca²⁺ 含量会改变材料的表面化学，从而调节附着于表面的特定蛋白。上图中SDS-PAGE电泳也显示随着钙比例的增加，蛋白质吸附量降低了，蛋白质组成也似乎发生渐进性变化，尤其是在50-75 kDa分子量范围内变化显著。总体而言，Si90Ca10 和 Si60Ca40 随时间无统计学显著差异，而其他组可观察到明显差异（如下图）。
关于 Ca²⁺ 对吸附蛋白数量的影响，Si/Ca 比例似乎存在阈值，从 Si70Ca30 开始显示蛋白吸附减少。这些结果揭示了蛋白-BG 相互作用的复杂性，无疑确定了某些量的钙决定了蛋白在蛋白冠形成过程中的行为。遗憾的是这种行为背后的原理仍不清楚，值得我们进一步研究。
总体来说，我们认为钙离子可以在多个维度赋予微球更多再生功能，这里的微球不仅限于羟基磷灰石微球，甚至包括钙离子改性的其他类别微球，为内卷的产品指了一条新方向：
钙离子缓解酸性微环境，促进ECM合成 - PLLA降解产生酸性产物（乳酸），而PLLA/BG释放Ca²⁺等多价阳离子，将局部pH调节至弱碱性（~7.7），对抗酸中毒。
钙离子调控巨噬细胞极化及炎症微环境 - PLLA/BG显著诱导巨噬细胞向M2表型极化（CD206阳性细胞比例达64.4%），降低M1标志物CD86及相关促炎基因（Nos2、IL-1β），上调M2相关基因（Arg-1、Ccl17）
钙离子通过PDLIM5信号通路发挥作用 - PLLA/BG显著提高PDLIM5（一种钙依赖性衔接蛋白）的基因和蛋白水平表达。
钙离子影响蛋白冠形成及免疫识别 - 材料表面蛋白冠的形成具有时间动态性（Vroman效应），钙离子及孵育时间会改变蛋白冠的组成，尤其在50–75 kDa范围变化显著。
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